除完整的細胞可作為抗原外，各種不同的細胞內存在的各種分子量不同的物質，也都具有全抗原或半抗原的性質，某種抗原物質可能是某一類細胞所*的，可作為這種細胞的一個標志。由于細胞存在著許多性質不同的抗原物質，有時要從這眾多的物質中提取、純化某種抗原物質，以供科學研究之用。
一、抗原的提取
抗原的制備是一件十分細致的工作，要制備一個高純度的抗原，需要付出艱巨的努力，制備工作涉及物理學、化學和生理學等許多領域的知識。根據(jù)物理或化學特性建立起來的分離、純化方法的主要原理不外乎科二個方面：①利用混合物中幾個組分分配率的差別將他們分配到可用機械方法分離的兩或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑抽提、層析和結晶等；②把混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同的區(qū)域而達到分離的目的，如電泳、超速離心和超濾等。由于組織細胞內存著許多分子結構和理化性質不同的抗原物質，其分離方法也不一樣，就是同一類大分子物質，因選材不同，所使用的方法也很大差別。因此很難有一個通用的標準方法供提取任何生物活性物質使用，所以在提取前必須針對所欲提取的物質，充分查閱文獻資料，選用合適的方法。如果要提取一個結構及性質未知的抗原物質，更需要經(jīng)過各種方法的比較探索，才能找到一些工作規(guī)律和獲得預期的效果。
抗原物質的制備，大概要經(jīng)過如下過程：①材料的選擇和預處理；②細胞的粉碎（細胞器的分離）。③提取；④純化；⑤濃縮或干燥，保存?，F(xiàn)分別簡述如下。
?。ㄒ唬┎牧系倪x擇及預處理
選擇什么材料主要根據(jù)實驗目的而定。通常選含量高、工藝簡便、成本低的材料。材料選定后，通常要進行預處理，剔除結締組織、脂肪組織等，把組織塊剪碎。若取材后不立即進行提取，則應冷凍保存，動物組織更要深低溫保存。某些容易失活的物質，一般宜采用新鮮材料。
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除了提取體液、組織間液內的多肽、蛋白質、酶不需粉碎細胞外，凡要提取組織內、細胞膜上及胞內的生物活性物質，都必須把組織和細胞粉碎，使活性物質充分釋放到溶液內。不同的組織，細胞的破碎難易不一，因此所使用的粉碎方法也不*相同。如腦、胰、肝等比較軟嫩的組織，用普通勻漿器研磨就行，肌肉、心臟等則需絞碎后再作勻漿?，F(xiàn)漿常用的細胞粉碎方法介紹如后。
1．物理法
?。?）高速組織搗碎機：通常由調速器、支架、馬達、帶桿刀葉、有機玻璃筒等組成。把材料放于筒內（約占筒內容積的1/3）固定筒蓋，開動馬達，調速器由慢逐漸增至所需速度。此法適用于內臟組織。
?。?）玻璃勻漿器：由一個內壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（球面經(jīng)過磨砂）玻璃研桿組成。把絞碎的組織置于管內，加適量溶液，插入研桿，用手或電動轉動研桿，并上下移動。用此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機高，對大分子的破壞也少。是粉碎少量軟嫩材料（腦、胰、肝等）時常用的方法。
?。?）超聲波處理法：多用于軟嫩組織，根據(jù)不同組織采用不同頻率，處理10～15min，超聲波處理時溶液溫度升高，使不耐熱的物質失活，使用時為防止溫度升高，除間歇開機外，還需人工降溫，避免溶液內存在氣泡。核酸及某些酶對超聲波很敏感，要慎用。
?。?）反復凍融法：把待碎樣品冷卻到零下15～20。C，凍固后取出，緩慢解凍，如此反復操作，可使大部分動物性細胞及胞內的顆粒破碎，但也可使生物活性物質失活。
（5）冷熱交替法：把材料投入90。C左右水中維持數(shù)分鐘后取出投入冰浴內，可使大部分細胞破碎?？捎糜谔崛〉鞍踪|和核酸。
2．化學和生物化學法
?。?）自溶法：把新鮮材料置于一定的pH和適宜的溫度下，利用組織細胞自身的酶系統(tǒng)把組織破壞，使細胞內容物釋放出來。動物材料的自溶溫度選在0～4℃，需加少量防腐劑，自溶時間較長，不易控制，不常用。
?。?）溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細胞壁。在每毫升含2億個細胞的懸液中加100μg至1mg溶菌酶，37℃，保溫10min，細胞就破壞了。此外，蝸牛酶、纖維素酶也被選作破碎細菌細胞之用。
（3）表面活性劑處理法：較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。
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提取、抽提、萃取這3個詞的含義基本相同。但一般說來，提取是指在分離純化前期，將經(jīng)過處理或粉碎了的細胞置于一定條件和溶劑中，讓被提取物充分地釋放出來的過程，而抽提則是貫穿于分離純化的整個過程中，如在制備核酸過程中，用氯仿反復提取蛋白液，用苯酚反復抽提分離DNA和RNA。影響提取的因素主要來自被提取物在提取的溶劑中的溶解度大小以及它由固相擴散到液相的難易。一個物質在某一溶劑中的溶解度大小和該物質的分子結構及使用的溶劑的理化性質有關。一般說來，極性物質易溶于極性溶劑，非極性物質易溶于非極性大分子的等電點遠的pH值使溶解度增加。因此，在不同的抗原提取過程中，所選用的溶劑的性質、pH值、離子強度、抽提溫度、介電常數(shù)等因素是提取成敗的重要因素。要達到分離提純的目的，必須靈活地應用這些因素。
現(xiàn)將蛋白質、核酸、多肽等抗原（半抗原）的提取方法概要敘述于下。
1．蛋白質和酶的提取 蛋白質是由許多氨基酸連接而成的高分子物質，分子量從數(shù)千至百萬。數(shù)以千計的蛋白質，按它們的功能可分成兩大類，一類是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、受體蛋白、運動蛋白、運輸和貯存蛋白、防御蛋白等等，另一類是非活性蛋白，如膠原蛋白、角蛋白等，不同的蛋白質由于其結構的差異，它們溶解度也各不相同。大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結合的蛋白質則溶于有機溶劑乙醇、丙酮、丁醇等。這對選擇撮蛋白質的溶劑具有重要意義。
?。?）水溶液提?。河捎诘鞍踪|大部分溶于水、稀酸和稀堿溶液，因此提取蛋白質以水溶液為主，其中尤以稀鹽液和緩沖液對蛋白質穩(wěn)定性好，溶解度大，氫是zui常用的溶劑。應注意下列幾點：①鹽濃度，常用等滲溶液，尤以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液、0.15mol/L氯化鈉溶液應用較多。如酵母脫氫酶以0.66mol/L磷酸氫二鈉溶液提取，6-磷酸葡萄糖脫氫酶以0.1mol/L碳酸氫鈉液提取，脫氧核糖核蛋白在低鹽溶液中溶解度小，就要用1mol/L以上的氯化鈉液提取，而某些脂肪酶，用水提取比低鹽溶液提取效果更好。②pH值的選擇對蛋白質提取頗為重要，因為蛋白質的溶解度和穩(wěn)定性與pH值關系很大。提取液的pH值首先要保證在蛋白質穩(wěn)定的范疇內，通常在等電點的兩側，堿性蛋白如細胞色素C和溶菌酶選在偏酸一側，酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶應選在偏堿一側。③溫度：為防止活性蛋白變性、降解而失活，溫度通常選在5℃以下。對少數(shù)耐溫的蛋白質和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離，有利于提純，如胃蛋白酶、酵母醇脫氫酶以及許多多肽激素可選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。
?。?）有機溶劑提?。阂恍┎蝗苡谒?、稀鹽、稀酸或稀堿溶液的蛋白質和酶，常用不同比例的有機溶劑來提取。如用70%～80%乙醇提取麩蛋白；用60%～70%的酸性乙醇提取胰島素，既可抑制水解酶對胰島素的破壞，又可除去大量雜蛋白，用丁醇提取某些附于微粒體和線粒體的酶，一些與脂質結合牢固的蛋白質和酶以丁醇提取，效果較好。我國生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脫氫酶和堿性磷酸脂酶。丁醇提取法對pH及溫度的選擇范圍較廣（Ph3～10）,溫度由零下2℃～40℃均可。
2．核酸的提取 核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（RNA），另一類為脫氧核糖核酸（DND）。核酸的分子量極大，人數(shù)萬致億萬。核酸是兩性化合物，在一定的等電點。溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有機溶劑。細胞內的核酸常和蛋白質結合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質溶液中的溶解度有顯著區(qū)別，有一定濃度范圍的氯化鈉溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度隨著氯化鈉濃度增加而逐漸下降，當氯化鈉濃度為0.14mol/L時，其溶解度僅為水中溶解度的1/100，但當氯化鈉濃度再增加時，脫氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化鈉濃度增加到0.5mol/L時，其溶解度與水中溶解度相似，當氯化鈉濃度增加到1mol/L時，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化鈉溶液中仍有相當大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化鈉溶液提取核糖核蛋白，而提取脫氧核糖核蛋白時，則用1mol/L氯化鈉溶液。兩種核糖核蛋白的溶解度與溶液的pH也有關。當pH為4.2時，脫氧糖核蛋白的溶解度zui低，而pH為2.0～2.5時，核糖核蛋白的溶解度zui低。所以調節(jié)氯化鈉溶液的濃度和pH值，可使核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白分離開來。
?。?）RNA的提?。篟NA在細胞中主要有三種類型，即rRNA（核微粒核糖核酸）、tRNA（轉移核糖核酸）和mRNA（信使核糖核酸）。mRNA代謝極不穩(wěn)定，提取時要求條件較嚴格；tRNA當細胞破碎后，用酸處理得到“pH5”沉淀，即可從中分離tRNA；rRNA占全部RNA的80%以上，比較穩(wěn)定，一般提取的大分子RNA主要為此部分。核內rRNA常先將細胞核分離后，再進行提取，可避免其他細胞組分RNA的干擾。
RNA的提取，通常是用0.14mol/L氯化鈉溶液將組織做勻漿并反復提取細胞質中的核糖核蛋白，而留下含有DNA的細胞核物質，然后用10%醋酸調至pH4.2沉淀，離心棄去上清液，先用0.5mol/L氯化鈉溶液，后用水洗滌沉淀，將核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氫鈉溶液中，離心，取上清液，調pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌，再一次除去脫氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白質可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氫鈉水溶液中，加入乙醇，RNA即以鈉鹽形式沉淀出來。
提取RNA另一類方法，不須事先用0.14mol/L氯化鈉提取核糖核蛋白，而一步將RNA的蛋白質分開，并同時把RNA抽提出來，此類方法是在破碎細胞做成勻漿時，加入去污劑十二烷基磺酸鈉或二甲苯磺酸鈉；而現(xiàn)在zui常用的方法是直接加入含水苯酚與勻漿一起振蕩，DNA和蛋白質沉淀于酚層中，水層中含RNA和多糖，然后用乙醇使RNA沉淀，四種物質一步便可初步分離開。苯酚法是目前提取不降解的RNAzui有效的方法，其應用舉例如下：
肝臟rRNA的提?。喊锤沃兀r）加入10倍容積苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸餾水中，另加入0.5g 8-羥基喹啉配成）及10倍容積的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/V）做勻漿后在20℃攪拌20min。
肝臟細胞核內mRNA的提?。合确蛛x細胞核，再將核懸浮于3倍容積的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液（g/V）中勻漿后加入等量90%（g/V）苯酚水溶液（內含0.1%8-羥基喹啉）在2℃振蕩提取30min。
酵母tRNA的提?。?00g酵母（濕重）加入200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振蕩2h,4℃冰箱中過液，使之提取*。
以上介紹了用冷酚法提取各種RNA的一些實例，近來還有皂土酚法（即除苯酚外還加入皂土吸附蛋白質）提取RNA，據(jù)報道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但應用苯酚法提取核酸時，須注意市售苯酚常含有少量重金屬和雜質，可能導致核酸降解，使用時，一般需要減壓重蒸。
（2）DNA的提?。篋NA主要存在于細胞核中，天然狀態(tài)的DNA絕大多數(shù)是以脫氧核糖核蛋白形式存在。人細胞中提取DNA時，一般先獲得脫氧核糖核蛋白，再將蛋白質除去，從中分離DNA。常用的方法是以1mol/L氯化鈉溶液抽提，得到的脫氧核糖核蛋白溶液與含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振蕩，除去蛋白質。或者在組織細胞破碎后以低濃度0.14mol/L氯化鈉溶液（也可用0.1mol/L氯化鈉加0.05mol/L檸檬酸代替）反復洗滌除去核糖核蛋白，再以1mol/L氯化鈉提取脫氧核糖核蛋白，提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白質。兩種方法比較，后一種方法使核酸降解可能少一些。以稀鹽溶液提取DNA時，加入適量去污劑更有助于蛋白質與DNA的分離。
應用苯酚法也可以提取DNA而且不用經(jīng)過脫氧核糖核蛋白這一步驟，例如大鼠肝勻漿在6%對氨基水楊酸鹽溶液內，加入同體積90%苯酚水溶液，室溫下提取1h，再經(jīng)進一步提純可獲得98%～99%純度的DNA。苯酚法也是目前提取DNAzui常用的方法之一。
3．活性多肽及遞質的提取大體上與蛋白質的提取方法相似，可參照進行。經(jīng)典神經(jīng)遞質如去甲腎上腺素、腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺等均可化學合成，無需用很多精力去提取。
?。ㄋ模┛乖姆蛛x與純化
從細胞中提取出來的生物大分子是不純凈的，必須進一步分離純化才能獲得純品。在生物大分子制備工作中，分離純化是比較復雜和重要的一個環(huán)節(jié)。對于異類的物質，如提純蛋白質和酶時混雜著核酸，提純核酸時混雜著蛋白質或多糖，一般可用專一性酶水解、有機溶劑抽提、選擇性分部沉淀等方法處理，小分子物質常在整個制備過程中多次液相與固相互相轉化被分離或zui后用透析方法除去。而對同類物質，如酶和雜蛋白，RNA和DNA以及不同結構的蛋白質、酶、核酸之間的分離，情況則復雜得多，主要應用的方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、吸附法、結晶法、電泳法、超速離心法、柱層析法等。其中鹽析法、等電點法、結晶法用于蛋白、酶的提純較多；有機溶劑抽提和沉淀用于核酸提純較多；柱層析法、梯度離心法在蛋白質和核酸的提純工作中應用均十分廣泛。本節(jié) 側重對蛋白質、酶和核酸分離純化中與溶解度有關的一些方法作一簡要敘述。
1．蛋白質分離純化的一些方法
?。?）鹽析法
①原理：鹽析法對于許多非電解質的分離純化都是適合的，也是蛋白質和酶提純工作應用zui早，至今仍廣泛使用的方法。其原理是蛋白質、酶在低鹽濃度下的溶解質隨著鹽液濃度升高而增加（此時稱為鹽溶）；當鹽濃度不斷上升時，蛋白質和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，稱為蛋白質的鹽析。這一現(xiàn)象是由于蛋白質分子內及分子間電荷的極性基團有著靜電引力，當水中加入少量鹽類時，由于鹽類離子與水分子對蛋白質分子上的極性基團的影響，使蛋白質在水中溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時，蛋白質表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質就相互聚集而沉淀析出。鹽析法就根據(jù)不同蛋白質和酶在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。
?、邴}的選擇：蛋白質鹽析常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、*、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用zui廣的是硫酸銨，其優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大（25℃時飽和溶解度為4.1mol/L,即767g/L;0℃時飽和溶解度為3.9mol/L，即676g/L），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來，而且硫酸銨價廉易得，分段效果比其他鹽好，不容易引起蛋白質變性。應用硫酸銨時，對蛋白氮的測定有干擾，緩沖能力比較差，故有時也應用*，如鹽析免疫球蛋白，用*的效果也不錯，*的缺點是30℃以上溶解度太低。其他的中性鹽如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好，但也由于溶解度太低，受溫度影響大，故應用不廣。
硫酸銨濃溶液的pH在4.5～5.5之間，市售的硫酸銨常含有少量游離硫酸，pH值往往降至4.5以下，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節(jié) 。
?、哿蛩徜@飽和度計算法及加入方式：在分段鹽析時，加鹽濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時其溶液飽和度調整方法有3種。一是當?shù)鞍踪|溶液體積不大，所需調整的濃度不高時，可加入飽和硫酸銨溶液；飽和硫酸銨配制方法可加入過量的硫酸銨，熱至50～60℃保溫數(shù)分鐘，趁熱濾去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天，有固體析出時即達100%飽和度。鹽析所需飽和度可按下式計算：
式中V及V0分別代表所需飽和度硫酸銨溶液及原溶液的體積，S2及S1分別代表所需達到的和原溶液的飽和度。嚴格來說，混合不同體積的溶液時，總體積會發(fā)生變化使上式造成誤差，但這由體積改變所造成的誤差一般小于2%。故可忽略不計。另一種是所需達到飽和度較高而溶液的體積又不再過分增大時，可直接加入固體硫酸銨，其加入量可按下式計算：
式中X是將1升飽和度為S1的溶液提高到飽和度為S2時所需硫酸銨的重量（g），G及A為常數(shù)，與溫度有關。G在0℃時為707，20℃時為0.29。為方便起見，在室溫及℃時所需硫酸銨的飽和度可直接查表2-1、表2-2求出。
表2－1 室溫下由S1提高到S2時每升加固體硫酸銨的克數(shù)
0.10 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
0 55 113 114 175 209 242 278 312 350 390 430 474 519 560 608 657 708 760
0.10 57 67 118 149 182 215 250 287 325 365 405 448 494 530 585 634 685
0.20 29 59 90 121 154 188 225 260 298 337 379 420 465 512 559 610
0.25 29 60 91 123 157 192 228 265 304 345 386 430 475 521 571
0.30 30 61 93 125 160 195 232 270 310 351 394 439 485 533
0.35 30 62 94 128 163 199 235 275 315 358 403 449 495
0.40 31 63 96 131 166 205 240 280 322 365 410 458
0.45 31 64 98 133 169 206 245 286 330 373 420
0.50 32 63 100 135 172 211 250 292 335 380
0.55 33 66 101 138 176 214 255 298 344
0.60 33 67 103 140 179 219 261 305
0.65 34 69 105 143 182 224 267
0.70 34 70 108 146 187 228
0.75 35 72 110 149 170
0.80 36 73 112 152
0.85 37 75 114
0.90 37 76
0.95 38
?、茺}析時注意的幾個問題
1）鹽的飽和度：鹽的飽和度是影響蛋白質鹽析的重要因素，不同蛋白質的鹽析要求鹽的飽和度不同。分離幾個混合組分的蛋白質時，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加，每出現(xiàn)一種蛋白質沉淀進行離心或過濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質沉淀。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質，飽和度達20%時，纖維蛋白原首先析出；飽和度增至28%～33%時，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至33%～50%時，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時，白蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，從牛胰中酸性提取分離可得到九種以上蛋白質及酶。
2）pH值：在等電點時，蛋白質溶解度zui小容易沉淀析出，因此，鹽析時除個別情況外，pH值常選擇在被分離的蛋白質等電點附近。
3）蛋白質濃度：在相同鹽析條件下，蛋白質濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度的極限愈低，如血清球蛋白的溶度從0.5%增到3.0%時，需用中性鹽的飽和度的zui低極限從29%遞減至24%。某一蛋白質欲進行兩次鹽析時，第1次由于濃度較稀，鹽析分段范圍較寬，第2次則逐漸收窄，例如用硫酸銨鹽析膽堿酯酶時，第1次硫酸銨飽和度為35%至60%，第2次為40%至60%。蛋白質濃度高些雖然對沉淀有利，但濃度過高也容易引起其他雜蛋白的共沉作用，因此，必須選擇適當濃度，盡可能避免共沉作用的干擾。
表2-2 0℃下由S1提高到S2時每100ml加固體硫酸銨的克數(shù)
溶液的原始飽和度（%） 飽和度 在0℃時所達到硫酸銨飽和度（%）
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
在100毫升中欲加固體硫酸銨的克數(shù)
0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7
5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2
10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7
15 2.6 5.4 6.2 11.1 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 34.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2
20 0 2.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7
25 0 2.7
5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.5 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2
30 0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8
35 0 2.8 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.4 29.1 32.9 36.9 41.0 45.3
40 0 2.9 5.8 8.9 12.0 15.3 18.7 22.2 25.8 29.6 33.5 37.6 41.8
45 0 2.9 5.9 9.0 12.3 15.6 19.0 22.6 26.3 30.2 34.2 38.3
50 0 3.0 6.0 9.2 12.5 15.9 19.4 23.0 26.8 30.8 34.8
55 0 3.0 6.1 9.3 12.7 16.1 19.1 23.5 27.3 31.3
60 0 3.1 6.2 9.5 12.9 16.4 20.1 23.9 27.9
65 0 3.1 6.3 9.7 13.2 16.8 20.5 21.4
70 0 3.2 6.5 9.9 13.4 17.1 20.9
75 0 3.2 6.6 10.1 13.7 17.4
80 0 3.3 6.7 10.3 13.9
85 0 3.4 6.8 10.5
90 0 3.4 7.0
95 0 3.5
100 0
4）溫度：由于濃鹽液對蛋白質有一定保護作用，鹽析操作一般可在室溫下進行，至于某些對熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。雖然蛋白質在鹽析時對溫度要求不太嚴格，但在中性鹽下結晶純化時，溫度影響則比較明顯。
5）脫鹽：蛋白質、酶用鹽析法沉淀分離后，常需脫鹽才能獲得純品。zui常用的脫鹽方法是透析法，如圖2-1所示：把蛋白質溶液裝入透析袋中，袋的二端用線扎緊，然后用蒸餾水或緩沖液進行透析，這時鹽離子通過透析袋擴散到水或緩沖液中，蛋白質分子量大不能穿透析袋而保留在袋內，通過不斷更換蒸餾水或緩沖液，直至袋內鹽分透析完畢。透析需要較長時間，常在低溫下進行，并加入防腐劑避免蛋白質和酶的變性或微生物的污染。
此外用葡聚糖凝膠脫鹽的效果也很好，其原理和應用方法在這里不贅述。
圖2-1 透析裝置圖
?。?）有機溶劑沉淀法：有機溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質分子上不同電荷的引力，導致溶解度的降低；另外，有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質的水化膜，故蛋白質在一定濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱“有機溶劑分段沉淀法”，它常用于蛋白質或酶的提純。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度有機溶劑易引起蛋白質變性失活，操作必須在低溫下進行，并在加入有機溶劑時注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。由此法析出的沉淀一般比鹽析容易過濾或離心沉降，分離后的蛋白質沉淀，應立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度。操作時的pH值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質的等電點附近，有機溶劑在中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度，減少變性，提高分離的效果，在有機溶劑中添加中性鹽的濃度為0.05mol/L左右，中性鹽過多不僅耗費有機溶劑，可能導致沉淀不好。沉淀的條件一經(jīng)確定，就必須嚴格控制，才能得到可重復的結果。有機溶劑濃度通常以有機溶劑和水容積比或用百分濃度表示。有機溶劑沉淀蛋白質分辨力比鹽析法好，溶劑易除去；缺點是易使酶和具有活性的蛋白質變性。故操作時要求條件比鹽析嚴格。對于某些敏感的酶和蛋白質，使用有機溶劑沉淀尤其要小心。
?。?）等電點沉淀法：利用蛋白質在等電點時溶解度zui低而各種蛋白質又具有不同等電點的特別進行分離的方法，稱為等電點沉淀法。但在等電點時，各種蛋白質仍有一定的溶解度而使沉淀不*，同時許多蛋白質的等電點十分接近，故單獨使用此法效果不理想，分辨力也差。大多用于提取后去除雜蛋白，即利用變動提取液的pH值使某些與待提純的蛋白質等電點相距較大的雜蛋白從溶液中沉淀出。實際工作中常把等電點沉淀和鹽析法、有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用。
?。?）吸附法：在蛋白質的提純方法中，選擇性吸附也是應用歷史較久迄今仍在廣泛采用的方法之一。早期工作常用高嶺土 （我國的一種土質，其分子式大致是AL2O3·2SiO2·2H2O）、氧化鋁（AL2O3）及活性炭等吸附劑，由于這些吸附劑吸附力較弱，或者易引起蛋白質變性而應用不廣，現(xiàn)已為凝膠性吸附劑所代替，如氫氧化鋁凝膠和磷酸鈣凝膠，尤其后者使用zui廣。吸附劑的應用有兩種不同方式。當?shù)鞍踪|較易吸附時，可以選擇適當條件主要吸附蛋白質而分離去雜質；當?shù)鞍踪|較難吸附時，則選擇利于吸附雜質條件將雜質與蛋白質分開。有時兩種方法可先后使用，以達到較高的提純目的。吸附條件通常在微酸性條件（pH5～6）及稀鹽溶液中進行，鹽濃度過高會干擾對蛋白質及酶的吸附，亦即是說需要用更多量的吸附劑才能達到一定結果。洗脫時一般在弱堿條件下或適當提高洗脫液離子強度，可將吸附的蛋白質或酶*洗脫下來。
吸附操作可以用靜態(tài)吸附，也可以用柱層析吸附，即將凝膠裝成柱進行吸附操作。凝膠裝柱后如溶液的通過能力很差，可用助濾劑（如硅藻土）和凝膠混合，當調整二者的比例時得到一系列通過能力和吸附能力不同的層析柱。zui近還使羥基磷灰石[Ca10（PO4）6．（OH）2]分離蛋白質和酶，它可以在高鹽濃度下吸附中性及酸性蛋白質而排除堿性蛋白質。吸附常在pH6.8的磷酸緩沖液中進行。洗脫*時凝膠可反復使用3～4次，吸附雜質較多的凝膠以0.1mol/L*或1mol/L鹽酸洗凈后再用。
?。?）離子交換法：蛋白質和酶都具有電解質性質，故可用離子交換劑進行分離提純，特別是經(jīng)過了初步純化后的蛋白質和酶采用此法效果尤為顯著。有關離子交換劑及其使用技術，參閱有關專著，這里介紹近年來以纖維素衍生物作為離子交換劑純化蛋白質及酶的方法。在這類衍生物中以二乙氨基乙基纖維素（簡稱DEAE-纖維素，為陰離子交換劑）及甲基纖維素（簡稱CM-纖維素，為陽離子交換劑）應用zui廣泛。
DEAE-纖維素是纖維素結構中的氫原子被一定量的二乙氨基-乙基取代而成弱堿性化合物，它作為陰離子交換劑的原理是：
在實際工作中常用磷酸緩沖液平衡DEAE-纖維素后，才對蛋白質進行交換吸附的，故上式B-可視為PO3-。用DEAE-纖維素吸附酶和蛋白質時常用pH為7～9，然后提高鹽濃度（使蛋白質與交換劑的結合鍵減弱）或降低pH使之洗脫，洗脫后的蛋白質溶液有時可進一步上CM-纖維素柱純化。作為陽離子交換劑，CM-纖維素吸附蛋白質的原理如下：
式中A+可為H+或Na+，視平衡CM－纖維素時所用溶劑而定。CM－纖維素常選在pH4.5～6.0左右吸附蛋白質，然后提高pH或鹽濃度進行洗脫。離子交換纖維素對大分子物質有較大交換量，例如CM-纖維素對血紅蛋白的交換量為93～98mg/100mgCM-纖維素。此外，纖維素離子交換劑還具有層析條件溫和、物質易于洗脫、分辨力強、被分離的蛋白質不易變性等優(yōu)點。
除了纖維素離子交換劑外，離子交換凝膠也是目前應用于分離蛋白質和酶的一種很好的離子交換劑。常用的有DEAE-葡聚糖凝膠和CM-葡聚糖凝膠。離子交換凝膠不僅具有交換當量高、層析條件溫和、操作簡便等優(yōu)點，而且兼具分子篩的性能，在梯度洗脫時，對不同分子量的蛋白質具有很高的分辨能力。
2．核酸的分離純化 從細胞中提取核酸后，仍混雜著蛋白質、多糖和各種大小分子核酸同類物。除去這些“雜質”的過程，也就是核酸提純過程。在核酸的分離純化時，為防止核酸大分子的變性降解，必須在0～4℃的低溫條件下操作。核酸酶的水解作用，是過去制備具有活性核酸大分子的嚴重障礙，現(xiàn)普遍采用加入去污劑或加入EDTA、8-羥基喹啉、檸檬酸鈉以除去核酸酶的激活劑Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保證在提純過程中核酸大分子的完整。關于核酸分離純化階段中除去多糖、蛋白質及不同類型核酸之間分離的一些方法，分別介紹如下：
?。?）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學性質與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來。除去的方法常有：①取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細胞內肝糖元大大減少。②加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。③在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機層中。④以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。
?。?）蛋白質的除去：由于核酸在細胞內以核蛋白體形式存在，不論采用哪種方法提取核酸，蛋白質都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質是核酸分離純化不可避免的步驟。常用方法有下列幾種：①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復使用。③苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DNA或RNA都可以進入水相，蛋白質則沉淀于酚層，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。
?。?）不同類型核酸的分離：兩種類型核酸的制備過程中，DNA制品中混雜著少量RNA或RNA制品中混雜著少量DNA是經(jīng)常發(fā)生的。由于DNA和RNA結構和性質都很相似，而且分子量都十分大，所以兩類核酸的分離是核酸純化工作中比較復雜和繁瑣的一步。從DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，這是比較有效的方法，但使用的核糖核酸酶中常含有極微量的脫氧核糖核酸酶，必須事先加熱處理除去，然后將純凈的核糖核酸酶與樣品溶液一起在37℃孵育數(shù)分鐘，就可達到破壞RNA的目的。②鈣鹽分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10體積10%的氯化鈣溶液，使DNA與RNA均成為鈣鹽后，再利用DNA鈣鹽在2/10體積乙醇中能形成沉淀析出，RNA鈣鹽不形成沉淀而彼此分離。③活性炭吸附：將處理好的活性炭按1/15～1/20體積加入每毫升含有0.5～1mgDNA溶液中，0～4。C下攪拌1h ，以31000×g離心1h，除去RNA后的DNA回收率可達94%。
在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法。在沒有陰離子化合物存在下，以等體積90%苯酚水溶液反復抽提RNA，可以除去絕大部分DNA。此外，也可采用加入脫氧核糖核酸酶處理，破壞DNA，或參考上述DNA與RNA分離方法將DNA除去。
?。?）同類核酸的分離
?、賀NA混合物的分離：經(jīng)過提取的初步純化的RNA制品中含有各類RNA和某些已降解的RNA混雜物。進一步純化時，多應用柱層析、梯度離心及逆流分溶等方法。例如tRNA與rRNA的分離用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化鈉溶液洗脫，或用蔗糖梯度（頂部5%濃度，底部20%濃度）離心法分開。mRNA的代謝速度較快，在細菌中平均壽命為90min，在哺乳動物中約為幾小時至十幾小時，常用密度梯度離心法和DNA-瓊脂柱進行分離。制備rRNA時，由于共沉作用，?；煊衜RNA，一般可用萘-1，5-二磺酸處理，使二者分開。各種tRNA的提純，通常采用逆流分溶法在磷酸緩沖液-甲酰胺-異丙醇系統(tǒng)下進行，分離效果較好。
?、贒NA混合物的分離：主要是變性或降解的DNA和天然的分離，常用磷酸鈣、ECTEOLA-纖維素、DEAE-纖維素和甲基化白蛋白柱層析，逆流分溶，梯度離心等方法。一個具有生物活性高度提純的DNA制品應具有如下標準：不含有蛋白質及多糖；不含有可透析的小分子雜物；在pH7時紫外吸收zui大值在257～261μm之間，E（P）在6600左右；不含有RNA；固體為纖維狀，水溶液具有高的粘度并有流動雙折射作用；具有電泳均一性及超離心中單分散性；具有生物活性。
（五）抗原的濃縮
濃縮是低濃度溶液通過除去溶劑（包括水）變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^程，在制備生物大分子及各種生化產(chǎn)品時，常在提取后和結晶前進行濃縮，有時也貫穿在整個制備過程中。沉淀（包括鹽析和有機溶劑沉淀），廣義上來說也是一種濃縮方法，經(jīng)過沉淀再溶解，濃度可大大提高，但有時提取液很稀，體積又很大或結晶前除去少量溶劑，則常用其他方法濃縮。
1．蒸發(fā)法 液體在任何溫度下都在蒸發(fā)，蒸發(fā)是溶液表面的溶劑分子獲得動能脫離液面逸向空間的過程。當溶液受熱，液體中溶劑分子動能增加，蒸發(fā)過程加快。蒸發(fā)的快慢和溫度、蒸發(fā)面積、液體表面積、液面蒸汽分子密度，即蒸汽壓大小有關。各種液體在一定溫度下都具有一定飽和蒸氣壓，當液面上的溶劑蒸氣分子密度很小，經(jīng)常處于不飽和的低壓狀態(tài)，液相與氣相的溶劑分子為了維持其分子密度的動態(tài)平衡狀態(tài)，溶液中的溶劑分子就必須不斷地氣化逸出空間，以維持其一定的飽和蒸氣壓力。因此，根據(jù)上述原理，蒸氣濃縮裝置常按照加熱、擴大液體表面積、低壓和加速空氣流動等因素而設計的。
2．冰凍法 冰凍法也是生物大分子及其他有機化合物濃縮的一種有效方法。生物大分子在冰凍時，水分結成凍，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中。操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質融解點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液，用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮于液面，蛋白質和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
吸收法 是一種通過吸收劑直接吸收溶液中的溶劑分子使溶液濃縮的方法。使用的吸收劑必須與溶液不起化學反應，對生物大分子不起吸附作用，易與溶液分開，吸收劑除去溶劑后能重復使用。實驗室中zui常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝膠等。使用凝膠時，首先選擇凝膠粒度大小恰好溶劑及低分子物質能滲入凝膠內，而生物大分子卻*排除于凝膠之外的，然后將洗凈和干燥的凝膠直接投入待濃縮的稀溶液中，凝膠親水性強，在水中溶脹時，溶劑及小分子被吸收到凝膠內，生物大分子留下剩余的溶液中，離心或過濾除去凝膠顆粒，即得已濃縮的生物大分子溶液。凝膠溶脹時吸收水分及小分子物質可同時起到濃縮及分離純化兩種作用，對生物大分子結構和生物活性都沒有影響。是近年來生物化學及分子生物學日益廣泛使用的濃縮和分離方法之一。
使用聚乙二醇等其他吸收劑時，需先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，扎緊袋口，外加聚乙二醇復蓋，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被溶劑飽和后，可更換新的，直到濃縮至所需的濃度為止。用完一次以后的聚乙二醇經(jīng)過加熱除去溶劑便可再次使用。
4．超濾法 超濾法是使用一種特制的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法。當溶液在一定壓力下（外源氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶液和小分子透過，大分子受阻保留于原來溶液中，其原理如圖2—2所示。這一近年發(fā)展起來的新方法是適于生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持生物大分子生理活性、回收率高等優(yōu)點。除去濃縮、脫鹽外，并可應用生物大分子的分離純化，是目前民展較快且為人們所采用的生化技術之一。
圖2-2 超濾法示意圖
通過超濾法，蛋白質和酶的稀溶液一般可濃縮到10%～15%濃度，回收率高達90%。超濾法應用關鍵在于膜選擇。不同類型的規(guī)格的膜、水的流速（在規(guī)定壓力下以ml/cm2/h或分表示）、分子量截止值（即大體上能被膜保留分子zui小分子量數(shù)值）等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作的需要來選用。此外，超濾裝置形式、溶質成分及性質、溶液濃度及粘度都對超濾的效果有一定影響。
制品濃縮到一定程度，即可貯存，如有必要可采用低溫干燥（冰干）的方法除去制品中溶劑，使之成干粉。
制品的貯存可分干態(tài)貯存和液狀貯存。但不論是何種方法貯存，都要避免長期暴露在空氣中，防止微生物的污染。溫度對生物活性物質的活性影響很大，在絕大多數(shù)情況下應采取低溫保存。
干態(tài)儲藏：干燥的制品一般比較穩(wěn)定，如制品含水量很低，在低溫情況下，生物大分子活性可在數(shù)個月甚至數(shù)年沒有顯著變化。儲藏方法也很簡單，只將干燥后的樣品置于干燥器內（內裝有干燥劑）密封，保持0～4℃冰箱中即可。有時為了取樣方便和避免取樣時樣品吸水和污染，可先將樣品分裝成許多小瓶中，每次用時，只取一小瓶。
液態(tài)儲藏：液態(tài)儲藏的優(yōu)點是使樣品減去干燥這一步驟，生物大分子的生理活性和結構破壞較少，缺點是需要較嚴格的防腐措施，儲藏時間不能太長。如樣品量大時封裝運輸不方便，實驗室常采取少量安瓿封存方法。液態(tài)儲藏注意事項如下：
樣品不能太稀，必須濃縮至一定濃度后才能封裝儲藏，樣品太稀時容易引起生物大分子變性作用。
一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白質和酶常用的穩(wěn)定劑有蔗糖、甘油等，如酶也加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性，此外鈣、鋅、硼酸等鹽溶液對某些酶也具有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸與氯化鈉的標準緩沖液中。
儲藏溫度要求較低，大多數(shù)在0℃左右冰箱保存即可，有的則要求更低溫度。但注意某些具有活性的大分子如DNA溶液低溫保存時，有宜使溶液結冰以造成其分子結構被破壞，另也有文獻報道某些蛋白質和酶在低溫中反而引起變性。故應分別情況對待，不能一概而論。
生物大分子和各種生化制品的儲藏和保存，總的來說，溫度和水分是影響穩(wěn)定性的兩個重要因素，其次是各種穩(wěn)定劑的應用是否適當關系也很大。實際應用時，必須對各方面都加以考慮。
所提取、純化的抗原物質，在使用前應進行定量測定。定量測定的方法，可根據(jù)不同的物質，選擇合適的方法進行。
某些分子量較小的抗原，如肽類半抗原，由于其結構較為簡單，目前已有化學合成的純品供應，不必自己去從組織中提取?；瘜W合成是一項專門技術，可參閱有關書籍。
二、免疫原的制備
用為免疫動物產(chǎn)生抗體的抗原物質如果是人工合成的。質地比較純，免疫動物后可獲得質量好的抗血清。如果以從組織中提取的物質作為抗原，必須經(jīng)過純化，保證提取物的純凈，才能獲得質量好的抗血清。某些物質的分子量比較小，抗原性弱，屬于半抗原，不易使動物產(chǎn)生抗體，必須把這些半抗原連接到大分子物質（載體）上，形成較為理想的免疫原，既能減少免疫注射的次數(shù)，又可節(jié)約抗原，產(chǎn)生良好的免疫效應，獲得高質量的抗體。
?。ㄒ唬┹d體
用為作為載體的物質較多，下列幾類可供選擇。
蛋白質類載體：人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、兔血清白蛋白（RSA）、牛甲狀腺球蛋白（TG）、血藍蛋白（Hemocyanin）以及人、牛和雞γ-球蛋白等均可作為載體。這些載體免疫活性較強，有商品供應，容易獲得，即使自選提取，操作也較方便。常用 的有TG、BSA、HAS等，以TG為好。
多肽聚合物，人工合成的多聚賴氨酸 、多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等，可與半抗原結合，所形成的免疫原可獲高滴度、高親合度的抗血清。
大分子有機化合物和某些粉末，如聚乙烯吡咯酮、羧甲基纖維素、聚甲基丙酸酯微粒、乳膠和炭末等，可吸附半抗原，也可用來作為載體，但用這類載體合成的免疫原免疫動物，所獲抗血清的質量不穩(wěn)定。
載體，尤其是大分子物質本身就是一種抗原，它們進行體內，可發(fā)揮致敏作用，激活免疫系統(tǒng)，從而使半抗原也可以使機體產(chǎn)生的抗體。因此，如果把半抗原與無免疫原性的載體結合，就不能使機體產(chǎn)生抗體。另外，半抗原與載體結合后，可適當延遲其降解和排出體外，從而可以發(fā)揮更久的作用。
（二）偶聯(lián)劑
半抗原和載體聯(lián)接，操作比較簡單，在一般實驗室中都可進行。但對反應條件有一定的要求：在反應過程中半抗原的免疫活性不發(fā)生改變，也不應引起載體變性到不溶解的程度。常用的方法是利用偶聯(lián)劑把半抗原和載體聯(lián)接起來。用作偶聯(lián)劑的有碳化二亞胺類、戊二醛、二異氰酸化合物和二鹵化*等。這些偶聯(lián)劑使半抗原與載體在-COOH、-NH2或-SH等基團部位發(fā)生結合。
碳化二亞胺偶聯(lián)過程示意如下：
由反應過程可見，碳化二亞胺的偶聯(lián)作用即可以在NH2部位發(fā)生，也可發(fā)生在羧基部位。
戊二醛所起的偶合作用與碳化二亞胺有所不同，戊二醛的兩個醛基分別與載體和半抗原的-NH2結合。它起一種“橋梁”作用，而把載體與半抗原聯(lián)接在一起，其反應過程為：
在免疫原的制備中，應根據(jù)不同的半抗原選用偶聯(lián)劑。
?。ㄈ┲苽溥^程
以制備催產(chǎn)素（OT）免疫原為例：
（1）1mgOT，溶解于1ml 雙蒸餾水或0.25%醋酸溶液中。10mgTG溶解于1ml 0.1mol/LPBS（pH7.5）或蒸餾水內。
?。?）把OT溶液與TG溶液振蕩混勻。
?。?）邊攪拌邊滴加入0.25%戊二醛1ml。加畢后再攪拌5～10min，在室溫下繼續(xù)反應2～3h，就可供免疫動物用。
免疫原以新制備的為好，如果一次制備了較多的免疫原，也可保存在-40℃的低溫冰箱內備用。
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