国产精品视频500部丨天堂视频中文在线丨狠狠色伊人亚洲综合网站l丨136fldh导航福利视频丨亚洲综合激情丨yes4444视频在线观看丨人人草网站丨精品国产露脸对白在线观看丨成人国产欧美大片一区丨亚洲国产剧情中文视频在线丨亚洲色图欧美视频丨精品久久网丨成人福利网丨久久精品这里丨大奶毛片丨暖暖日本在线观看丨国产美女a做受大片观看丨国产精品色拉拉丨日韩中文字幕在线专区丨九九av在线丨久久午夜精品视频丨肉丝美脚视频一区二区丨草草视频网站丨久久精品视频在线看丨欧美性欧美zzzzzzzzz

PCR由變性–退火–延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

① 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;

② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;

③ 引物的延伸：DNA模板–引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

④ 重復(fù)循環(huán)變性–退火–延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。

每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。

反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)"，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩亍?/p>

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開(kāi)始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段"。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段")結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段"。不難看出“短產(chǎn)物片段"是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段"則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。

試劑

DNA模板，與特定DNA模板結(jié)合的引物，去離子水，商業(yè)化的DNA聚合酶以及緩沖液，dNTP, MgSO4（可選）和DMSO（可選）

PCR反應(yīng)開(kāi)始前的準(zhǔn)備工作

PCR反應(yīng)開(kāi)始前，你需要準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或者反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動(dòng)設(shè)計(jì)或利用軟件設(shè)計(jì)）并選擇合適的商業(yè)化DNA聚合酶（根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的不同做出決定）。

1. DNA聚合酶的選擇。市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇自己實(shí)驗(yàn)需要的產(chǎn)品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到?jīng)]有任何突變的PCR產(chǎn)物，那應(yīng)當(dāng)選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Taq聚合酶已經(jīng)足夠。另外要注意的一點(diǎn)是，進(jìn)行T載體連接的時(shí)候，要了解高保真的聚合酶所得的產(chǎn)物是沒(méi)有A末端的，因此你在T載體連接之前需要進(jìn)行加A反應(yīng)?；蛘咧苯舆x用普通的Taq聚合酶。

2. 引物。引物特異性會(huì)影響到PCR反應(yīng)成功的可能性，好的引物設(shè)計(jì)對(duì)PCR成功至關(guān)重要。設(shè)計(jì)引物時(shí)，有以下幾條原則需要謹(jǐn)慎考慮：

1. 引物長(zhǎng)度。通常PCR引物長(zhǎng)度在18-22個(gè)堿基之間。這對(duì)引物的特異性以及退火溫度而言均已足夠。

2. 解鏈溫度Tm。Tm值的定義是使得一半雙鏈DNA解螺旋成為單鏈DNA的溫度。引物的Tm值通常要在52-58度之間。

3. GC含量。GC含量為40-60%。

就目前而言很多軟件都可以用來(lái)設(shè)計(jì)引物，如primer5和Oligo。通常這些軟件設(shè)計(jì)得到的引物均可以滿足需要。

步驟

準(zhǔn)備好各種試劑和PCR儀，就可以開(kāi)始PCR實(shí)驗(yàn)：將各種試劑混合并按照說(shuō)明書設(shè)置PCR反應(yīng)。一般PCR循環(huán)如下：

1. 起始步驟：這對(duì)于熱啟動(dòng)PCR而言是必須的，將反應(yīng)混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時(shí)間取決于所選用的DNA聚合酶。

2. 變性步驟：DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，而DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合。在這一步，反應(yīng)混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環(huán)中的第一步。

3. 退火步驟：變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在。因?yàn)榉磻?yīng)體系中的引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50-65度時(shí)，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。這一步通常維持20-40秒，而聚合酶會(huì)結(jié)合至引物-模板雙鏈處開(kāi)始DNA合成。

4. 延伸步驟：在這一步，DNA聚合酶開(kāi)始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的溫度。通常我們選用72度，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補(bǔ)規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時(shí)間取決于目的DNA片段的長(zhǎng)度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長(zhǎng)度的DNA。

5. 第2步至第4步稱為一個(gè)循環(huán)：每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)。在前幾輪的PCR循環(huán)過(guò)程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長(zhǎng)，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制。

6. 最后的延伸步驟：當(dāng)30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，我們通常會(huì)以68-74度延伸5-10分鐘，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢。

7. 維持時(shí)間：通常我們?cè)O(shè)置4-10度為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。