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試劑盒產(chǎn)地：比利時(shí)Bio-X
1.     檢測原理                           8.  工作液的準(zhǔn)備
2.     操作時(shí)間                           9.  樣品前處理
3.     檢測下限                           10. 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
4.     回收率                             11. 操作步驟
5.     交叉反應(yīng)率                         12. 結(jié)果計(jì)算
6.     試劑盒的組成                       13. 結(jié)果分析
7．需要設(shè)備及試劑                     14.注意事項(xiàng)
 
簡介： 
   克倫特羅（Clenbuterol）屬于beta興奮劑，是一種高選擇性的興奮劑和激素，具有水解脂肪、合成代謝和對(duì)非條紋肌肉組織的松弛作用。進(jìn)年來被一些人非法添加到飼料中以提高脂肪型動(dòng)物的瘦肉率和加速動(dòng)物的生長。當(dāng)用作生長調(diào)節(jié)劑時(shí)，其添加量是治療量的5—10倍，常在動(dòng)物體內(nèi)殘留而給消費(fèi)者帶來危害。
通常，HPLC或GC-MS是克倫特羅殘留檢測的確證方法，但是其前處理步驟費(fèi)用昂貴，而ELISA快速檢測試劑盒因成本低、操作簡便、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化低，現(xiàn)已成為常規(guī)的篩選方法。
1.檢測原理：
測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板上包被有針對(duì)兔IgG（Clenbuterol抗體）的羊抗體，含有克倫特羅抗原的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記物被加入到小孔中，經(jīng)過孵育及洗滌步驟后，游離的抗原與抗原酶標(biāo)記物競爭抗體結(jié)合位點(diǎn)，沒有結(jié)合的抗原酶標(biāo)記物在清洗步驟中被除去，將顯色液加入到孔中并且孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色。在450nm處測量，吸光強(qiáng)度與樣品的克倫特羅濃度成反比。
2.操作時(shí)間：1小時(shí)（30分鐘孵育+30分鐘顯色）
3.檢測下限：0.1ppb
4.回收率：
尿樣和血清：                 97-110%
飼料：                       95-100%  
肝臟/組織：                  90-97%
牛奶及奶粉                   100%
5.交叉反應(yīng)率：
Clenbuterol （克倫特羅）         100%
Mabuterol（馬普特羅）          100%
Mapenterol（馬噴特羅）         100%
Salbutamal （沙丁胺醇）          8-9%
Terbutalin （特普他林）          7-8%
Simarterol（塞曼特羅）           <0.1%
Isoproterenol（異丙腎上腺素）  <0.1%
Fenoterol（非諾特羅）          <0.1%
6.試劑盒的組成：
1） 96孔酶標(biāo)板：12條╳8孔（包被有抗兔IgG）.
2） 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液6瓶：1ml /瓶，為Clenbuterol水溶液:0.1ng/ml，0.3 ng/ml，0.6 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml.
3）酶聯(lián)結(jié)合物Conjugate peroxidase：                     6ml    黃蓋
4） 抗Clenbuterol抗體溶液：Anti-clenbuterol antibody     11ml   紅蓋
5） 沖洗液（需10倍稀釋）Wash buffer：                    50ml   塑料瓶
6） 檸檬酸鹽緩沖液Citrate buffer：                       25ml   藍(lán)蓋
7）底物溶液Chromogen：                                  3 ml   黑蓋
8）樣品稀釋液（需20倍稀釋）Diluent solution:            10ml   綠蓋
9）反應(yīng)終止液Stop solution：                            6ml    白蓋

7.需要設(shè)備及試劑（試劑盒中未提供）
設(shè)備：
1）  均質(zhì)器
2）  振蕩器
3）  微孔酶標(biāo)儀（450nm）
4）  離心機(jī)
5）  20ul，50ul，100ul，200ul微量加樣器
6）  免疫親和柱（每根柱子可以至少可以純化120-150個(gè)樣本，也可以用C18柱純化）。
試劑：
1）  *
2）  0.01M  HCL
3）  5M鹽酸
4）  蒸餾水
8.工作液的準(zhǔn)備：
1）  洗液：用蒸餾水按（1+9）稀釋
2）  樣品稀釋液：將樣品稀釋液用蒸餾水按（1+19）稀釋（注：在使用前再配）。
3）  底物溶液：用檸檬酸緩沖液（1+9）稀釋（注：檸檬酸緩沖液本試劑盒內(nèi)有提供，稀釋后的溶液避免光線直射）。
注：終止液含硫酸，要小心操作。
9.樣品前處理：
9.1尿液和血清：（稀釋因子1）
尿液和血清不用處理，直接測定。（如果尿液渾濁，一定要過濾或離心）
9.2肝臟
9.2.1（簡便前處理方法）（稀釋因子3）
1）  取1g肝臟樣品，加入2ml0.01M HCL.
2）  均質(zhì)5分鐘.
3）  檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用*或鹽酸調(diào)節(jié).
4）  離心15分鐘3500rpm，或者離心5分鐘13000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液備用.
9.2.2.（復(fù)雜前處理方法）（稀釋因子1）
1）  帶有低脂肪的肝，肉或組織.
2）  5g粉碎的樣品于25ml 50mM 鹽酸混合，振蕩15分鐘，以達(dá)到均質(zhì)的目的。
3）  稱6g均質(zhì)物（相當(dāng)于1g肝臟），加入離心瓶中。
4）  10—15℃離心15分鐘4000rpm或更高的轉(zhuǎn)速。
5）  轉(zhuǎn)移出上清液至另一個(gè)離心瓶中，加300ul 1M *混合15分鐘。
6）  加入4ml 500mM 磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0，簡單混合并在4℃保存至少1.5小時(shí)或過夜
7）  在10-15℃離心15分鐘，4000g或更高轉(zhuǎn)速。
8）  分離全部上清液（應(yīng)該是清亮的），使其升至室溫（20-24℃），然后用C18柱純化（見C18柱純化步驟）。
C18柱純化方法：
所有試劑和樣品處理必須在室溫下（20-24℃）并嚴(yán)格控制過柱時(shí)的流速。（非常關(guān)鍵）
1）  用3ml100%甲醇洗滌柱子，流速為1滴/秒。
2）  用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0）。
3）  樣品進(jìn)柱。
4）  用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0）。
5）  用正壓去除殘留的液體并用空氣或氮?dú)獯?分鐘干燥柱子。
6）  用1ml100%甲醇洗脫樣品，流速為15滴/分鐘。
7）  在50-60℃弱空氣或氮?dú)饬飨?蒸發(fā)溶劑。
8）  用1ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，備用分析。
9.3飼料（稀釋因子10）：
1） 用乳缽研碎飼料，稱1g研碎的飼料樣品加入10ml0.01M的鹽酸，充分混合5分鐘。
2） 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用*或鹽酸調(diào)節(jié)
3） 離心5分鐘3500rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）
4） 直接取上清液進(jìn)行檢測
9.4牛奶和奶粉（稀釋因子50）：
1） 取1g奶粉或1ml牛奶于50ml試管中，加3ml（牛奶加2ml）蒸餾水
2） 加100ul 5M的鹽酸（調(diào)節(jié)PH至3）
3） 升溫至40℃3-5分鐘直至牛奶凝化，離心5分鐘3500rpm
4） 加5M*100ul，加入46.8ml蒸餾水，用*或鹽酸調(diào)節(jié)pH值為6.5-8之間
5） 離心15分鐘3500rpm，取上清液進(jìn)行檢測
9.5組織樣品（稀釋因子50）：
1）1g粉碎的樣品于50ml 試管，加50ml 0.01M HCL混合，振蕩5分鐘，以達(dá)到均質(zhì)的目的。
2） 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用*或鹽酸調(diào)節(jié)
3） 離心5分鐘3500rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）
4） 直接取上清液進(jìn)行檢測
10.酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
1） 將所有試劑升至室溫20-25℃，一旦開始實(shí)驗(yàn)，一定要連續(xù)不間斷。
2） 所有標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣為減少操作誤差，同時(shí)做平行實(shí)驗(yàn)。
3）檢測樣品建議做平行實(shí)驗(yàn)（可以減少實(shí)驗(yàn)過程中因操作失誤而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。
11.操作步驟：（孵育時(shí)間30分鐘）
1） 按照所要進(jìn)行測驗(yàn)的微孔板條，從酶標(biāo)板中取出所需的微孔板條并插入框架內(nèi)。
2） 吸取50ul的蒸餾水作為0標(biāo)樣。
3） 吸取50ul標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品入各自的微孔內(nèi)。
4） 每孔內(nèi)加入50ul酶聯(lián)結(jié)合物，然后再加入100ul 克倫特羅抗體溶液（該反應(yīng)速度快，建議使用多道移液器）。
5） 輕輕敲擊微孔板四周，室溫20-25℃避光孵育30分鐘。
6） 傾空微孔板，用250ul沖洗液重復(fù)洗板5次，zui后，用力在吸水紙上將殘余液滴拍干（洗板時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)清洗液注滿微孔，翻轉(zhuǎn)微孔板傾空，盡量擠壓微孔板，以防微孔板從框架上脫落）。
7） 顯色：每孔加200 ul顯色液，室溫20-25℃避光孵育30分鐘（顯色液用1體積底物溶液+9體積檸檬酸緩沖液） 8） 孵育結(jié)束時(shí)，每孔加50ul反應(yīng)終止液，充分混合，在450nm下讀數(shù)。
12.結(jié)果計(jì)算：
1） 樣品中未知的Clenbuterol通過曲線定量計(jì)算
2） 將得到的樣品吸光度值減去所有空白值的平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液吸光值和樣品吸光度值以及zui大吸光度值
3） 用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值（B）除以zui大吸光度值（B0）再乘以100，zui大吸光度值接近于100%的吸光度值百分率：

根據(jù)B/B₀的值做出每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的半對(duì)數(shù)曲線，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度就可從曲線上讀出。
13.結(jié)果分析：
由于樣品在反應(yīng)中經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的待測樣濃度一定要再乘以其稀釋因子才能得出其在樣品中的正確含量。（尿液和血清的稀釋因子是1，肝臟的稀釋因子是3，飼料的稀釋因子是10，組織的稀釋因子是50，牛奶和奶粉的稀釋因子是50）
14.注意事項(xiàng)：
1）  溫度低于20℃或試劑及標(biāo)品沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的值偏低。
2）  洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象，所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3）  標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在光線下。
4）  混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。
5）  反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。
6）  不要使用過了有效期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣回引起靈敏度降低。
試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，不要冷凍。